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        液氮超低溫凍結法詳細操作步驟

        時間:2020-06-08 16:19來源:未知 作者:班德液氮罐 點擊:
        液氮超低溫保藏技術是將菌種保藏在-196℃的液態氮,或在-150℃的氮氣中的長期保藏方法,它的原理是利用微生物在-130℃以下新陳代謝趨于停止而有效地保藏微生物。液氮罐

        操作步驟如下:

        1、安瓿管或凍存管的準備

        用圓底硼硅玻璃制品的安瓿管,或螺旋口的塑料凍存管。注意玻璃管不能有裂紋。將凍存管或安瓿管清洗干凈, 121℃下高壓滅菌15-20分鐘,備用。

        2、保護劑的準備

        保護劑種類要根據微生物類別選擇。配制保護劑時,應注意其濃度,一般采用10-20%甘油。

        3、微生物保藏物的準備

        微生物不同的生理狀態對存活率有影響,一般使用靜止期或成熟期培養物。

        分裝時注意應在無菌條件下操作。

        菌種的準備可采用下列幾種方法: 刮取培養物斜面上的孢子或菌體,與保護劑混勻后加入凍存管內;

        接種液體培養基,振蕩培養后取菌懸液與保護劑混合分裝于凍存管內;

        將培養物在平皿培養,形成菌落后,用無菌打孔器從平板上切取一些大小均勻的小塊(直徑約5-10毫米),真菌最好取菌落邊緣的菌塊,與保護劑混勻后加入凍存管內;

        在小安瓿管中裝1.2-2毫升的瓊脂培養基,接種菌種,培養2-10天后,加入保護劑,待保藏。

        4、預凍

        預凍時一般冷凍速度控制在以每分鐘下降1℃為好、使樣品凍結到-35℃。

        目前常用的有三種控溫方法:

        —— 程序控溫降溫法,應用電子計算機程序控制降溫裝置,可以穩定連續降溫,能很好地控制降溫速率。

        —— 分段降溫法:將菌體在不同溫級的冰箱或液氮罐口分段降溫冷卻,或懸掛于冰的氣霧中逐漸降溫。一般采用二步控溫,將安瓿管或塑料小管,先放-20℃至-40℃冰箱中1-2小時,然后取出放入液氮罐中快速冷凍。這樣冷凍速率大約每分鐘下降1-1.5℃。

        —— 對耐低溫的微生物、可以直接放入氣相或液相氮中。

        5、保藏

        將安瓿管或塑料凍存管置于液氮罐中保藏。一般氣相中溫度為-150℃,液相中溫度為-196℃。

        6、復蘇方法

        液氮罐中取出安瓿管或塑料凍存管,應立即放置在38℃-40℃水浴中快速復蘇并適當搖動。直到內部結冰全部溶解為止,一般約需50秒-100秒。開啟安瓿管或塑料凍存管,將內容物移至適宜的培養基上進行培養。

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