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        哲羅鮭精子冷凍保存分析

        時間:2020-05-18 09:24來源:未知 作者:班德液氮罐 點擊:
        1材料與方法

        1.1實驗材料利用新疆伊犁河恰甫其海水庫養殖的哲羅鮭(Huchotaimen)親魚21多尾,培育在(3×20)m2的長方形流水養魚池中,進排水量約(15~20)m3/h,在水溫達到8℃時對雄魚注射促黃體生成素釋放激素類似物(LRH-A2)2.5µg/kg和絨毛膜促性腺激素(hu-manchorionicgonadotropin,HCG)400IU/kg催熟,雄魚成熟后采用擠壓腹部法收集精液,采精時避免光線直射,將精液直接收集在50mL玻璃瓶中,置于事先放入冰塊的保溫盒中,帶回實驗室進行冷凍保存實驗。氣相液氮罐

        1.2精子稀釋液的配制和篩選利用市售NaCl、KCl、CaCl2·2H2O、MgCl2·6H2O、Na2、HPO4、NaHCO3、NaH2PO4、KHCO3、KOH、MgSO4、KH2PO4、葡萄糖、蔗糖、檸檬酸、Tris、胎牛血清(fetalbovineserum,FBS)、N-二(羥乙基)甘氨酸(bicine)、蛋黃、二甲基亞砜(dimethylsulfoxide,DMSO)配制了9種精子稀釋液和冷凍保存液:MPRS、RS、Hanks、ELS、EG1、EG2、Stein、SS-2、D15(表1)。分別利用以上精子稀釋液以1:1的比例稀釋精液,平衡5min后,利用OLYMPUS顯微鏡觀察并統計精子活力(運動精子/全部精子數)。然后分別在以上稀釋液中加入20%的DMSO,再以1:1的比例稀釋精液,平衡5min后在顯微鏡下觀察并統計精子活力。最后將稀釋后的精液分裝在2mL冷凍管中,每管注入稀釋精液1.0mL,采用三步法冷凍保存在液氮中。冷凍3~4h后,利用37℃水浴解凍精子,在顯微鏡下觀察并統計精子活力。

        表1精子稀釋液配方

        [精子稀釋液.jpg]

        1.3抗凍劑(甲醇和二甲基亞砜)濃度的篩選以ELS為稀釋液,分別以終濃度為4%、6%、8%、10%和12%加入抗凍劑甲醇(methanol)和DMSO,稀釋精液在加入冰塊的保溫盒中平衡20min后在顯微鏡下觀察并統計精子活力。然后將稀釋精液分裝在2mL冷凍管中,每管注入稀釋精液1.0mL,采用三步法冷凍保存在液氮中。冷凍3~4h后,利用37℃水浴解凍精子,在顯微鏡下觀察并統計精子活力。

        1.4葡萄糖濃度的篩選以D15為基礎稀釋液,在其中分別加入15%、20%、25%、30%、35%和40%的葡萄糖,再加入終濃度6%甲醇,以1:1的比例稀釋精液,在加入冰塊的保溫盒中平衡20min后在顯微鏡下觀察并統計精子活力。然后將稀釋精液分裝在2mL冷凍管中,每管注入稀釋精液1mL,采用三步法冷凍保存在液氮中。冷凍5h后,利用37℃水浴解凍精子,在顯微鏡下觀察并統計精子活力。氣相液氮罐

        1.5哲羅鮭精子在不同稀釋液中短期冷藏保存分別以D15、D30、Stein和ELS為稀釋液,以1:1的比例稀釋哲羅鮭精液,分別注入2mL冷凍管中,每管注入1.5mL,同時以未加稀釋液的鮮精作對照,將冷凍管置于保溫盒中,保溫盒中事先放入體積1/3的冰塊,保存溫度2~4℃。每隔5h在顯微鏡下觀察統計一次精子活力,直至精子完全失活。

        1.6數據統計分析利用SPSS19.0統計軟件對獲得的數據進行單因素方差分析(One-WayANOVA),采用Student-Newman-Keuls進行多重比較和差異顯著性分析,篩選精子活力最高的精子稀釋液配方、抗凍劑成份和濃度。利用Excel軟件對統計結果做圖,在圖中利用a、b、c后d等字母表示分析結果之間的顯著性差異,字母相同為無顯著性差異(P>0.05),字母不同具顯著性差異(P<0.05)。

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