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        研究凍融對綿羊精子ATP酶活性的影響

        時間:2020-05-18 09:19來源:未知 作者:班德液氮罐 點擊:
        摘要:為了充分發揮和提高優良種公羊的利用率,提高綿羊凍融精液品質,試驗采用酶動力學分光度法對冷凍保存前后小尾寒羊精子和精清中ATP酶活性變化進行研究。說明凍融過程對綿羊精子中ATP酶的活性造成了嚴重損傷。綿羊凍融精子ATP酶的活性可以在一定程度上預測精子活率,并可作為綿羊精液品質評價的重要指標。液氮罐價格

        1材料與方法

        1.1主要試劑

        甘油、D-(+)-葡萄糖、蔗糖、青霉素、鏈霉素,檸檬酸鈉、氯化鈉、0.2%TritonX-100、Tris-HCl緩沖液(0.1mol/L,pH值8.2)、ATP溶液,分析純。

        1.2主要儀器

        高速離心機(型號為ZONKIAHC–2518),紫外可見分光光度計(型號為TU-1810PC/SPC),顯微鏡(型號為CKX31)。

        1.3稀釋液的配制

        取基礎液(葡萄糖3g,蔗糖4g,檸檬酸鈉3g,超純水100mL,煮沸消毒)80mL,加20mL新鮮卵黃液,青霉素、鏈霉素各10萬IU配制成保存稀釋液;再取上述溶液94mL加入甘油6mL,配制成冷凍稀釋液。

        1.4精液采集與常規品質評定

        選取膘情中等、體質健康、性欲旺盛的小尾寒羊種公羊,用假陰道法采集精液,立即在37℃下進行常規品質評定,要求原精液密度達到“密”級,活率在0.8以上,無異常氣味,色澤乳白,用于試驗。

        1.5 精液冷凍保存與解凍

        1.5.1 精液的稀釋與平衡精液常規檢查后,將符合要求的新鮮精液根據活率和密度按3~6倍的比例,在35℃下用冷凍稀釋液等溫稀釋,混勻,在室溫下用0.25mL的塑料細管進行分裝并封口。裹8~10層紗布置于4℃冰箱中平衡2~3h。

        1.5.2 精液的冷凍與保存將平衡好的精液細管置于自制冷凍漂浮器上(距離液氮表面2.0~2.5cm,溫度在-110~-80℃)熏蒸10min,投入液氮保存。

        1.5.3 精液的解凍從液氮罐中取出精液細管,迅速浸入39~40℃水浴中,輕輕搖動直至融化(10~15s)。

        1.6 精子活率的評定將稀釋精液搖勻后,取中層精液10μL滴于經37℃恒溫板等溫預熱的載玻片上,蓋片后置于顯微鏡下放大400倍檢查精子1000個以上,分別計算呈直線運動精子數和總精子數,計算精子活率。

        1.7 ATP酶活性的測定

        1.7.1 ATP酶的提取精液總ATP酶粗提液:取120μL稀釋精液于離心管中,加入360μL0.2%TritonX-100,抽提20min,然后4000r/min離心30min,保留上清液待測。精清中ATP酶粗提液:取120μL稀釋精液于離心管中,加入自制稀釋液360μL2000r/min離心20min,保留上清液待測。精子中ATP酶粗提液:將上一步所得沉淀加入0.2%TritonX-100360μL抽提20min,4000r/min離心30min,保留上清液待測。

        1.7.2 ATP酶活性的測定取純化水2.21mL,ATP溶液1.10mL,混勻后加入25℃預熱的ATP酶待測液0.19mL(空白管用純化水代替),迅速搖勻倒入比色皿(光徑為1cm),700nm處每隔1min測定1次OD值,每次測5min。

        1.7.3 ATP酶活性的計算公式為:酶活力=(測定管OD值-對照管OD值)×1/(60×取樣量)×樣品稀釋倍數。液氮罐價格

        1.8 數據的統計與分析采用SPSS10.0統計軟件對試驗數據進行統計分析,差異顯著性采用Excel軟件中數據分析工具庫進行描述統計、t檢驗和方差分析。試驗重復5次以上。

        2.結果與分析

        結果見表1。由表1可見,與冷凍前相比,冷凍后小尾寒羊精子中ATP酶活性極顯著降低(P<0.01),精清中ATP酶活性極顯著升高(P<0.01),說明冷凍保存對綿羊精子中ATP酶的活性造成了嚴重損傷。冷凍前后精子活率與精子ATP酶活性均呈極顯著正相關(r=0.979和0.968,P<0.01),說明精子ATP酶活性能夠反映精子活率,可作為精液品質評價的指標。

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