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        研究豬胚胎多能樣干細胞分離培養的方法

        時間:2020-05-18 09:16來源:未知 作者:班德液氮罐 點擊:
        豬胚胎干細胞分離培養自我更新和分化潛能,利用不同培養條件,從孤雌胚胎、細胞核移植胚胎和體內受精胚胎中分離樣細胞。液氮容器

        1.細胞培養用于核移植供體的豬胎兒成纖維細胞

        從初生豬仔的耳部分離得到。細胞培養基為DMEM,15%胎牛血清,培養溫度為37℃,5%CO2。細胞凍存,使用0.25%(W/V)的胰蛋白酶消化,中和后離心200Xg,5min。將細胞重懸后并加入等量凍存液(40%DMEM,40%FBS和20%DMSO),貯存在液氮中。

        2.卵母細胞的收集和準備

        從屠宰場收集豬卵巢,保存在含有青/鏈霉素的生理鹽水中,運輸溫度32~38℃,3h內運回實驗室。采用抽吸法采集卵巢卵母細胞。抽取3~6mm卵泡中的卵母細胞置于15mL離心管中,37℃水浴靜置數分鐘,待卵母細胞沉降后,用洗卵液洗2遍,顯微鏡下挑取顆粒細胞層達3層以上的卵丘卵母細胞復合物(cumulusoocytecomplex,COCs),然后將COCs轉入U型皿中培養42~44h,每孔加500µL成熟培養液,每孔放置50~70枚。

        3.孤雌激活和胚胎培養

        用電融合儀將成熟的卵母細胞進行電激活,漂洗后,將卵母細胞移至2mmol/L6D孵育2.5h。分別將卵母細胞轉移到胚胎培養基G1、NCSU23和豬受精卵培養基,24h后記錄卵裂率。3d后,將培養基G1中發育的胚胎移入囊胚培養基G2。再次培養3~4d后,統計囊胚個數并收集。

        4.體細胞核移植胚胎培養

        去除成熟卵母細胞第一極體,隨后注入供體細胞。顯微操作后,移入含10%FBS的M199培養基,在38.5℃,5%CO2條件下孵育0.5h,使用電融合儀進行激活處理,移入6D孵育2.5h后,將重組胚胎在NCSU23培養基中培養3d,隨后替換NC-SU23繼續培養3~5d,觀察胚胎的發育。

        5.體內胚胎的收集

        從人工受精的母豬體內收集第7~8d的囊胚,所有方法參照Stokes等(2005)。每天監測母豬的發情,將發情日期作為0d,鑒定發情后的6、12和18h進行人工受精。從子宮沖洗胚胎時使用預熱的含10%FBS的磷酸緩沖鹽溶液(phosphatebuffersa-line,PBS)。

        6.從豬胚胎分離胚胎多能干細胞

        將去除透明帶的囊胚接種到絲裂霉素C(mi-tomycin-C)處理過的小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonicfibroblastcells,MEFs)飼養層上2~4d,囊胚內細胞團(innercellmass,ICM)在3~5d后出現。待ICM大小適中時,用機械法分離細胞,重鋪到新的飼養層上,并使用不同的豬胚胎干細胞(por-cineembryonicstemcells,pESCs)培養基(ESM1~ESM6,表1),胚胎多能干細胞克隆每5~7d使用機械法傳代。液氮容器

        7.免疫熒光檢測

        使用4%多聚甲醛固定胚胎10min,PBS洗2次后,加入0.25%Triton-X室溫30min,PBS洗3次,1%BSA室溫封閉1h,4℃孵育一抗24h(1∶200,CDX2;1∶200NANOG)。PBS沖洗3次,孵育熒光標記的二抗(1∶1000)室溫1h。PBS沖洗2次后,DAPI染色2min,PBS沖洗2次后在熒光顯微鏡下觀察照相。

        8.qRT-PCR

        使用0.5%鏈霉蛋白酶A去除豬胚胎的透明帶后,立刻加入5μL的裂解緩沖液(5mmol/L二硫蘇糖醇,1%NP-40,1U/uLRNA酶抑制劑),冰上孵育30min。使用反轉錄試劑盒將裂解液反轉錄為cDNA。qRT-PCR體系:cDNA2μL,SYBRgreenmix12.5μL,上下游引物各0.3µmol/L0.5μL,ddH2O補充到25μL。反應程序:95℃30s;95℃5s,60℃30s,共40個循環。

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